日本電信電話株式会社（本社：東京都千代田区、代表取締役社長：島田　明、以下「NTT」）は、炭素原子のみからつくられるシート状の物質であるグラフェン*1を立体化するNTT独自の技術*2を用いて、立体的な細胞塊*3の繋がった神経ネットワーク*4から長期的に神経活動を計測することに成功しました。
　立体化したグラフェンが培養細胞の足場*5になると同時に電極として機能することで、従来困難だった、複数の細胞塊からの長期的な計測(70日間)を可能にしました。細胞塊の繋がった神経ネットワークは、同期と非同期の混ざった神経活動*6の時空間パターンを示し、日数の経過に伴ってそのパターンが変化することも示されました。
　本成果は、脳の特徴的な構造を模した培養組織 (立体細胞塊のネットワーク)において神経機能を可視化することに成功したものであり、発生学や創薬研究を加速するBrain-on-a-chipの要素技術として活用されることが期待されます。
　本成果の詳細は、米国東部時間2023年5月1日、米国科学誌「Advanced Functional Materials」に掲載されました。

図1:（左）立体神経ネットワークの計測が可能な立体電極アレイ、
（右）Brain-on-a-chipのイメージ

1．研究の背景
　脳は神経細胞を素子としたネットワークとして機能する臓器であり、その素子がどのように集合して機能するのか、どのように成長するのか、明らかにされていないことが沢山あります。素子である神経細胞のレベルから集合体である脳まで統合的に仕組みを理解するために、細胞を積み上げて脳らしい培養組織を形成し、さらにその培養組織をデバイスチップ上に載せて生体情報を収集する、Brain-on-a-chip（脳模倣培養モデル）が近年注目されています。これまでに、神経細胞を立体的に積み上げるために足場を形成する組織工学*7の技術や、神経電極*8を立体化することで、立体細胞塊から神経活動を計測するデバイス技術が開発されてきました。一方で、複数の立体細胞塊のそれぞれに電極を配置・計測することが難しいという課題がありました。
　これまでにグラフェンと呼ばれる炭素原子の薄層を曲げて立体化する独自技術を開発しており、さらに円筒状になったグラフェン内部で神経細胞を育てることで立体細胞塊を形成することに成功しています。グラフェンは、導電性に優れているため神経電極として注目されています。また、その柔軟性が立体化技術の構成に必須であることに加え、従来の電極材料である金属と比べると生体適合性*9や透明性に優れ、細胞の生育や観察にも適しています。これらの利点により、立体的細胞塊の形成と計測電極としての機能を両立できる可能性を秘めていました。

2．研究の成果
　本研究では、立体化したグラフェンを計測電極として用いることで、グラフェン内部で育てた立体細胞塊の活動計測に成功しました (図1)。円筒状の立体電極の内部に立体細胞塊が形成されるため、立体細胞塊と電極とのペアを簡単に構成することができ、その接触を安定して保つことができます。実際に、平坦な電極上に立体細胞塊を培養した場合と比べて、3倍以上の神経活動が計測され、70日間にわたって安定して計測できることを実証しました (図2)。 図2：立体細胞塊からの長期的な神経活動の計測

　本研究では立体化する計測電極を多点(8×8点)で配置した電極アレイ*10を作製し、複数の立体細胞塊からの計測を実現しました。1つ1つの電極に対応した立体細胞塊からの独立な信号計測により個々の立体細胞塊同士が繋がった神経ネットワークの活動計測が可能です (図1)。従来の立体的でない2次元電極を用いた場合、培養細胞は平面的で一様なネットワークが形成され、細胞間で同期した活動*11が支配的です。一方で、立体細胞塊ネットワークでは、同期と非同期が混在した多様な神経活動の時空間パターン*12が生じ、さらにそのパターンは培養日数の経過に伴って変遷しました。実際の脳の中でも、細胞塊を個々のモジュール*13とした構造が多様なパターンを生み出していることが知られています。本研究では、立体細胞塊の形成と信号計測の技術を両立することで、脳内に見られる特徴的な構造(立体・モジュール構造)をもった培養神経が同期と非同期が混在した脳に近い神経活動のパターンを示すことを明らかにし、さらにその成長過程をモニタリングすることに成功しました（図3）。本技術は、脳らしい神経ネットワーク形成の一部をチップ状に再現することで、脳の機能への理解をより深める研究に寄与します。


図3：立体神経ネットワークにおける神経活動パターンの可視化と成熟過程

3．技術のポイント
①グラフェンの立体化による細胞塊形成と計測の両立
　NTTでは、これまで生体組織に対して親和性の高い種々の導電性材料を研究してきましたが、今回はグラフェンが生体適合性と導電性に優れた薄膜材料である点に着目し、自己立体化技術を用いることで細胞の足場としての機能と電極としての機能を両立しました。
　立体化する薄膜は、グラフェンとパリレンC*14と呼ばれるポリマー薄膜により構成されています(図1上部)。これらは、いずれも生体に優しい材料であり、立体化のプロセスで細胞にダメージを与えないことを確認しています。
　また、これまでのグラフェンとパリレンCの二層ではグラフェンを円筒の内側にすることが難しいという課題がありましたが、今回我々はグラフェンをパリレンCの両面に張り付けた三層構造にすることで、電極となるグラフェン面を内側にした立体化に成功ました。

②多点かつ長期的な計測による立体神経ネットワークの成熟評価
　個々の電極で細胞塊とのペアを形成・維持できる利点により、アレイ化した細胞塊のそれぞれから神経活動を安定して計測することが可能です。そのため、細胞塊同士がどのように結合を形成しているか、ネットワークに関する空間的な情報を取得することができます。
　さらに、長期計測の利点も併せることで、その結合の状態が細胞塊の成長に従ってどのように変化するのか可視化することが可能になりました。

4．今後の展開
　個々の立体細胞塊に複数の電極を配置して個々の立体細胞塊内部での信号分布を可視化することで、より詳細な細胞塊神経ネットワークの形成過程の観察が期待できます。今回扱った神経細胞は１種類のみですが、脳を構成する他の細胞や異なる領野の神経細胞、さらには疾患に関連する細胞を混ぜることで、多様な組織構造や状態を再現できるモデルとしての発展が期待できます。
　また、脳に似た環境で神経ネットワークの機能や薬剤の効き目を調べるためのBrain-on-a-chip実現に向けた要素技術の進展に寄与します。

5．論文情報
著者名：K. Sakai, T. F. Teshima, T. Goto, H. Nakashima, M. Yamaguchi
タイトル：Self-Folding Graphene-Based Interface for Brain-Like Modular 3D Tissue
論文誌名：Advanced Functional Materials
掲載日時：2023年5月1日（英国時間）

＜用語解説＞
*1グラフェン
炭素原子1層の厚みで構成される二次元材料で、高い導電性と透明性、生体適合性を有しています。物理的な特性だけでなく医工学的なアプリケーションに向けても注目されている材料です。

*2グラフェン自己組立て技術
グラフェンをポリマー薄膜に貼ることで自発的な屈曲を誘導するNTT独自の技術です。屈曲したグラフェンは、立体的なロール形状になります。また、細胞を培養するためのインターフェースとしても活用できます。
https://group.ntt/jp/newsrelease/2019/10/18/191018a.html

*3立体細胞塊
細胞同士が凝集して立体的な塊を形成したもので、スフェロイドやオルガノイドなどとも呼称されます。培養環境においても生体内に近い環境を構築することができます。

*4神経ネットワーク
神経細胞は、互いに結合してネットワークを形成することで情報をやり取りしています。計測された神経活動の相関性や同期性から細胞同士の結合を推定することができます。

*5足場
神経細胞は一般的に培養シャーレの上に接着して成長しますが、接着する足場を立体的に構築することで立体的な培養組織を形成されます。

*6神経活動
神経細胞は、細胞膜の電位を1msの間に急峻に上下させる一連の電気的な神経活動により情報を符号化しています。細胞周囲に配置した電極は、細胞膜外の電位変化を感知して神経活動を計測します。

*7組織工学
再生医療や創薬研究の支援に向けて、細胞を集めて目的の臓器の形や機能を持たせる技術分野です。

*8神経電極
神経細胞が神経活動に伴って生じる細胞外の電位変化を計測するための電極です。培養神経細胞を神経電極上に培養する方法の他に、生体内に電極を留置することで動物やヒトの神経組織から活動を計測することもあります。

*9生体適合性
細胞や生体組織と親和性があり、生体の異物に対する反応を惹起しない性質のことを指します。

*10電極アレイ
神経電極を基板上にアレイ化することで、基板上に育った神経細胞の集団の多点から神経活動を計測する方法です。神経細胞に直接的に電極を接触する方法(パッチクランプ法)と比較すると、細胞への障害が少なく長期的な計測に適しています。

*11同期活動
ある神経細胞が活動することで、その細胞と結合した神経細胞も活動が励起されます。複数の細胞が再現性よく近い時刻に活動することを同期した活動と呼び、脳内でも領野から異なる領野への情報伝達で見られます。培養神経ネットワークでは、同期した活動の特徴を調べることで細胞の結合状態を推定する研究が盛んに行われています。

*12時空間パターン
多点の電極で計測される神経活動は、空間的な情報をもつと同時に、その神経活動の同期性という時間的な情報にも意味があります。時空間的な活動のパターンが神経ネットワークの機能的な状態の指標の一つになります。

*13モジュール構造
ある機能をもつ単位をモジュール(部品)として、それらが結合することで全体としての機能を持つような構造を意味します。脳は、領野や細胞集団をモジュールとして、互いに連絡することで機能を実現しています。本研究では、立体細胞塊をモジュールとして、互いに神経線維で結合している点でモジュール構造が形成されています。

*14パリレンC
クロロパラキシレンを1つの単位とするポリマーで、生体適合性および絶縁性に優れています。芳香環を介してグラフェンとπ-π相互作用により密着するため、薄膜を曲げてもグラフェンが剥離しないという特徴があります。